Focus

Electroporation de plasmides in utero

Objectif 

    L'électroporation in utero est une approche simple et rapide pour moduler l’expression de gènes d’intérêt chez des souris en développement.

 

Protocole simplifié

L'électroporation in utero consiste à l’insertion de plasmides dans des cerveaux embryonnaires de souris. 

L’ADN contenu dans les plasmides peut avoir de nombreux objectifs. Certaines de ces séquences d’ADN auront une influence sur l’expression des gènes des embryons : un gène pourra être surexprimé ou son expression pourra être inactivée. Il est intéressant de noter que le plasmide est épisomique c’est-à-dire qu’il n’est pas inséré dans le génome donc s’il y a une copie d’un plasmide dans une cellule et qu’elle se divise , une seule des cellules filles aura la copie.

L’insertion de plasmides est possible à différents stades embryonnaires. Elle nécessite une opération chirurgicale. La première étape est l’anesthésie de la souris gestante pour pouvoir manipuler les embryons. Grâce à une aiguille, les plasmides sont injectés dans la région ciblée ou dans les ventricules d’où ils peuvent  diffuser dans une région plus large :

Figure 1 : Protocole d'électroporation in utero

La pénétration de l’ADN dans les cellules

Des électrodes placées sur les côtés de la tête des embryons permettent de créer un champ électrique et donc d’ouvrir les pores cellulaires. L’ADN des plasmides est chargé négativement, les plasmides se dirigent vers le pôle positif de l’électrode placée dans une zone spécifique. Cette méthode permet donc une haute précision spatiale. 

L’analyse des résultats

Après l’électroporation in utero, grâce à un microscope à fluorescence, il est possible d’observer les cellules ayant intégré les plasmides, si un fluorophore avait été intégré. 

Généralement, les embryons utilisés pour les expériences contrôles ont été électroporés avec des plasmides permettant d’intégrer un fluorophore dans les neurones mais n’impactant pas l’expression des protéines. Ainsi, il devient possible de comparer des images cérébrales d’un embryon dont les neurones sont visibles et d’un autre dont les neurones sont visibles et l’expression des protéines cibles est modulée. 

Selon les besoins des chercheurs, les effets de l'électroporation peuvent être analysés in vivo ou in vitro. 

Pour observer les différentes étapes de la neurogénèse in utéro, les résultats de l’électroporation peuvent être analysés avant la fin de la gestation. Après prélèvement des cerveaux au stade embryonnaire choisi, on peut effectuer des analyses in vitro sur des coupes très fines. 

Les conséquences de l’électroporation peuvent également être observées  in vivo chez des souriceaux ou des souris adultes.

Exemples d’application de cette méthode 

L’électroporation in utero permet notamment d’observer les conséquences de la modulation de l’expression d’un gène sur la corticogénèse. 

L’observation de la densité neuronale dans différentes sous-régions du cortex permet d’étudier les conséquences de cette modulation sur la migration neuronale. Par exemple, une densité plus importante au niveau de la plaque corticale (CP) par rapport à la zone intermédiaire (IZ) indique un stade de migration plus avancé.

Il est aussi possible d’utiliser un traceur neuronal pour une analyse morphométrique des dendrites. On peut ainsi comparer la forme des dendrites avec ou sans électroporation in utero. 

Intérêts de cette méthode 

La possibilité d’effectuer l’électroporation à un moment spécifique de la neurogénèse permet l’analyse de différentes régions du système nerveux selon le stade embryonnaire. De plus, de nombreux événements du développement peuvent être étudiés :  la prolifération, la migration cellulaire, la croissance des axones, le développement des dendrites, ou encore la synaptogénèse. 

La précision spatiale lors de l’insertion du plasmide est très utile lorsque l’on veut cibler des régions spécifiques du cerveau embryonnaire. Pour un meilleur contrôle temporel, il est aussi possible d’insérer des plasmides contenant des gènes activables ultérieurement, par exemple photoactivables. 

Avantages par rapport à d’autres techniques 

- Plus rapide que les méthodes transgéniques knock-in knock-out. 

- Meilleure précision spatiale par rapport à l’injection de virus 

- Possibilité d’introduire plusieurs plasmides dans les mêmes cellules, ce qui est difficile à réaliser avec des constructions virales.